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ECL/ECL Prime/ECL Selectを使ったウェスタンブロッティングの結果およびご感想

ECL PlusとPrimeの比較

検出結果画像
検出画像1

投稿者 muscle
投稿者所属 大学院生(博士)
投稿日 2011年02月21日
今回お使いいただいた試薬
ECL Prime
サンプル由来
組織
サンプル調製方法
ラット骨格筋をlysis bufferでホモジナイズしたのち、上清をLaemmli’s sample bufferに溶解した。
1ウェルあたりのサンプルアプライ量(µg)
10ug
目的タンパク質の名前
phospho-AMPKα Thr172
検出結果 & 検出条件 検出手段
CCDイメージャー
検出画像へのコメント
検出画像1:
レーン1:Caffeine(3 mM, 15 min)
レーン2:AICAR(2 mM, 30 min)
レーン3:Basal
露出時間
検出画像1:90s
一次抗体
phospho-AMPKα Thr172
一次抗体の希釈倍率(1:X)
1:1000
二次抗体
anti-rabbit Ig HRP
二次抗体の希釈倍率(1:X)
1:2500
普段主にお使いの検出試薬
ECL Plus
ECL/ECL Prime/ECL Selectをお使いいただいた際に変更した条件
変更していない
ECL/ECL Prime/ECL Selectをお使いいただいた感想など
ECL Plusに比べて、感度が数倍良いように思われる。
今回はブロッキングを5%スキムミルク1hで行ったので、バックグラウンドがやや濃くなった。
今後さらなる基礎検討をもとに、PlusからPrimeへの変更を考えている。

 

投稿者 GEヘルスケア
投稿者所属 サポートスタッフ
投稿日 2011年02月25日

ご投稿いただきありがとうございます (GEヘルスケア)


評価内容をECL Plusとの比較結果としてまとめていただき、ありがとうございました。
「ECL Plusに比べて、感度が数倍良いように思われる」とのこと、ご期待に応えた感度であれば幸いに存じます。
「バックグラウンドがやや濃くなった」との御感想も頂いており、添付して頂いたイメージを拝見するとECL Primeで検出して頂いたメンブレンでは、目的バンドも強いですが、レーンのバックグラウンドも高くなっています。
Muscle様がご記入頂いたとおり、ブロッキング条件を厳しく(時間の延長やブロッキング濃度を上げる)して頂くことは、バックグラウンドを抑える効果的な方法です。汎用的な内容ですでにご存知と思いますが、その他にバックグラウンド対策で効果的な方法としまして、3つ対処方法をご提案させて頂きます。
1. 露出時間を短縮する:微弱なシグナルを検出しにくくなるためバックグラウンドの低下が見込めます。
2. サンプル添加量を減らす:サンプルが泳動されたレーンの形でバックグラウンドが高い場合に有効な方法です。
3. 抗体濃度を希釈する:一次抗体、二次抗体の添加量を、ともに数倍希釈していただきます。貴重な抗体の節約にもお役立てください。今後ともよろしくお願いいたします。