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ECL/ECL Prime/ECL Selectを使ったウェスタンブロッティングの結果およびご感想

ECL PrimeとECL Plusの比較

検出結果画像
検出画像1

検出画像2

検出画像3

投稿者 hooter
投稿者所属 大学 講師
投稿日 2011年02月04日
今回お使いいただいた試薬
ECL Prime
サンプル由来
組織
サンプル調製方法
ブタ歯胚タンパク質をLDSサンプルバッファーにて抽出した。
1ウェルあたりのサンプルアプライ量(µg)
0.01-1
1ウェルあたりに含まれる目的タンパク質の量(ng)(推定)
N/A
目的タンパク質の名前
amelogenin
検出結果 & 検出条件 検出手段
CCDイメージャー
使用した製品名(CCDイメージャーの場合)
LAS1000
検出画像へのコメント
検出画像1:サンプル1μg(レーン1)、0.1μg(レーン2)、0.01μg(レーン3)を電気泳動後、PVDF膜に転写し、amelogenin抗体1と反応させた。
検出画像2:検出画像1の膜をマニュアルに従ってストリッピングを行った後、amelogenin抗体2と反応させた。
検出画像3:検出画像2の露光時間を検出画像1と同じにした。
露出時間
検出画像1:5分
検出画像2:30秒
検出画像3:5分
一次抗体
Anti-amelogenin 1 and 2 (rabbit, poly)
一次抗体の希釈倍率(1:X)
1:20,000
二次抗体
Peroxidase labelled anti-rabbit IgG (sheep)
二次抗体の希釈倍率(1:X)
1:5,000
普段主にお使いの検出試薬
ECL Plus
ECL/ECL Prime/ECL Selectをお使いいただいた際に変更した条件
サンプルアプライ量
変更内容詳細
ECL Plus使用時は5μg/lane.
予備実験でECL Primeではシグナルが強すぎたので、アプライ量を減らした.
ECL/ECL Prime/ECL Selectをお使いいただいた感想など
サンプル量および露光時間の比較から、PrimeはPlusの約10倍の感度を持つと感じた。しかしリプロービングにおいては、Primeはバックグランドが高い印象を受けた。

 

投稿者 GEヘルスケア
投稿者所属 サポートスタッフ
投稿日 2011年02月14日

ご投稿頂きありがとうございます。(GEヘルスケア)

ECL Plusとの詳細な比較検討をご投稿頂き、ありがとうございました。
サンプル添加量、リプロービング前後、更に露出時間など、様々な点からご検討頂き、大変貴重な情報をご提供頂き感謝いたします。
一度目の検出では、「PrimeはPlusの約10倍の感度を持つと感じた」とのご感想で、ご期待に応えた結果であれば幸いでございます。しかし、リプロービングにおいてバックグラウンドが高い傾向とのことで、イメージを拝見しましたところ、特に露出時間を5分まで延ばした場合にバックグラウンドのムラが目立つように見受けられました。
リプロービング操作で生じた微量なメンブレンノイズが、高感度なECL Primeを用いたことで検出されてしまうことが原因と考えられます。汎用的な内容ですでにご存知と思いますが、バックグラウンド対策で効果的な方法としまして、ブロッキング条件を厳しくする方法がございます。ブロッキング時間を延長(4℃、オーバーナイト)、または、ブロッキング剤の濃度を上げることで、改善すると考えられます。お時間がございましたら、是非、ご検討ください。