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ECL/ECL Prime/ECL Selectを使ったウェスタンブロッティングの結果およびご感想

IkappaB

検出結果画像
検出画像1

投稿者 TLU
投稿者所属 公的研究機関 管理職
投稿日 2011年01月17日
今回お使いいただいた試薬
ECL Prime
サンプル由来
細胞株
サンプル調製方法
RIPA (+protease inhibitors, phosphatase inhibitors)
1ウェルあたりのサンプルアプライ量(µg)
8
1ウェルあたりに含まれる目的タンパク質の量(ng)(推定)
N/A
目的タンパク質の名前
IkappaB
検出結果 & 検出条件 検出手段
X線フィルム
使用した製品名(CCDイメージャーの場合)
LAS-1000plus
検出画像へのコメント
検出画像1:
 HeLa 細胞を1μM MG-132 で1時間処理後、10ng/ml TNFα で刺激し、on ice で RIPA 中に回収、超音波で細胞とDNAを破砕した。
 レーンあたり8μgのタンパク質を泳動し、セミドライブロットでPVDF膜 (Millipore, immobilon) に転写(2mA/cm2, 45min)した。
5%スキムミルク/TBS-tween でブロッキングし、抗体との反応に進めた。
 検出反応時には、ECL に膜を5分間浸した後、フィルムに所定の時間露出する方法をとった。
LAS1000plus での露光は、パラフィルムに乗せた膜上に ECLprime の液を乗せたまま、吸い取らずに露光する方法で行った。
露出時間
検出画像1:
検出画像2:
検出画像3:
一次抗体
anti-human IkappaB (santa crutz SC-371)
一次抗体の希釈倍率(1:X)
1000
二次抗体
anti-rabbit POD (GE NA934V)
二次抗体の希釈倍率(1:X)
2500
普段主にお使いの検出試薬
ECL Western
ECL/ECL Prime/ECL Selectをお使いいただいた際に変更した条件
変更していない
ECL/ECL Prime/ECL Selectをお使いいただいた感想など
露光時間ベースで見積もった場合、ECL の 5分間より ECL prime の 3秒間のほうが信号強度が高いので、少なくとも100倍以上の感度差があることになる。
しかし、ECL を用いてフィルムで検出できているようなタンパク質の場合は、そのままの条件で ECL prime を用いるのは感度の違いが大きすぎて現実的ではないと思われる。
一方、 LAS1000plus といった古いタイプの CCD検出装置でも、ECL prime を用いればフィルム以上の検出感度が容易に得られることがわかった。
今回の例では、大雑把に露光時間ベースで見積もって、フィルムの1から2倍程度の感度があると推測される。

 

投稿者 GEヘルスケア
投稿者所属 サポートスタッフ
投稿日 2011年02月14日

ご投稿頂きありがとうございます。(GEヘルスケア)

TLU様、ECLとの比較結果をご投稿いただき、まことにありがとうございます。
LAS-1000plusとECL Primeの組み合わせにより、ECLとX線フィルムの組み合わせ以上の検出感度が得られたとのこと、今後もお役立ていただけましたら幸いです。
TLU様もお試しくださいましたように、ECLの実験条件のままECL Primeを使用いただく場合、試薬の検出感度上昇にともなって露光時間が短くなり、特にX線フィルムを用いる場合には露光をコントロールすることが難しい可能性があります。露出時間・感度の調整にてご対応いただくほか、抗体濃度をさらに希釈していただくという方法もあります。ぜひ一度お試しください。
万一ECLシリーズやLAS-1000plusに関してお困りのところがございましたら、どうぞお気軽にお問い合わせ下さい。

投稿者 GEヘルスケア担当 H
投稿者所属 GEスタッフ
投稿日 2011年02月03日

お待たせして大変申し訳ございません (GEヘルスケア)

ECL Primeの製品評価および実験結果の公開に格別のご協力をいただき、誠にありがとうございます。
お忙しい中、ご協力をいただいたにも関わらず、長い間お待たせすることとなり大変申し訳ございません。
予想を超える反響に十分な体制を準備できていませんでしたことが、このようにお待たせする原因となりました。
現在テクニカルスタッフの体制を増強して個別に回答・ご提案を準備中です。
(2月10日より順次、回答・ご提案を掲載予定です。)

どうかこれからも、GEヘルスケア・ジャパンをよろしくお願いします。