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ECL/ECL Prime/ECL Selectを使ったウェスタンブロッティングの結果およびご感想

ECL prime

投稿者 NS
投稿者所属 大学 助教
投稿日 2010年12月21日
今回お使いいただいた試薬
ECL Prime
サンプル由来
細胞株
サンプル調製方法
RIPA bufferを用いた
1ウェルあたりのサンプルアプライ量(µg)
20
1ウェルあたりに含まれる目的タンパク質の量(ng)(推定)
N/A
目的タンパク質の名前
tubulin
検出結果 & 検出条件 検出手段
X線フィルム
検出画像へのコメント
検出画像1:
検出画像2:
検出画像3:
露出時間
検出画像1:
検出画像2:
検出画像3:
一次抗体
anti-tubulin mouse
一次抗体の希釈倍率(1:X)
1:X2,000
二次抗体
anti-mouse HRP
二次抗体の希釈倍率(1:X)
1:X4,000
普段主にお使いの検出試薬
ECL Plus
ECL/ECL Prime/ECL Selectをお使いいただいた際に変更した条件
変更していない
ECL/ECL Prime/ECL Selectをお使いいただいた感想など
ECL plusと同じ抗体濃度だとシグナルが強すぎ、
またバックも高くなってしまい、扱いづらい印象を持った。ECL plusに比べて、抗体濃度が薄くても検出できるので、
貴重な抗体を用いている場合に用いると良いと思う。
私の場合は、ECL primeとの反応後一度露光し、
20分ほど後に最初と同じ時間で露光したらシグナルが
最初に比べて薄くなっていたので、ECL plusと同程度かは
わからないが条件によっては減衰も比較的短い時間で起こると考えられる。

 

投稿者 GEヘルスケア
投稿者所属 サポートスタッフ
投稿日 2011年02月09日

ご投稿頂きありがとうございます。(GEヘルスケア)

ECL Plusとの比較結果をご投稿いただき、ありがとうございました。
ECL PrimeはECL Plusと比べて2~4倍程度高感度な試薬であるため、NS様のおっしゃるように、ECL Plusと同条件ではシグナルが強すぎて、バックグラウンドも高くなる場合がございます。一次抗体と二次抗体を2~4倍程度希釈して頂くことで改善する事が確認されております。その他にも比較的簡単にバックグラウンドを抑制するための方法がございます。すでにお試しいただいている内容と重複するかもしれませんが、紹介させていただきます。
1. 露出時間を短くする:微弱なシグナルを検出しにくくなるためバックグラウンドの低下が見込めます。まずは、ECL Plus検出時の半分程度の露出時間でお試しください。
2. 抗体希釈溶液にブロッキング剤を添加する:ブロッキング時と同じ溶液にて一次抗体、二次抗体を希釈して処理する方法です。なお、目的タンパク質のシグナル強度も弱くなる側面もあるため、目的タンパク質がはっきり検出されている系での有効な改善手法としてご認識ください。

また、発光持続時間につきましてもご評価いただき、ありがとうございました。至適条件下では、ECL Primeは検出反応1時間後でも約60%のシグナル強度が持続することを確認しておりますが、NS様の評価内容を拝見し、実験条件(抗体濃度が高めの場合などが考えられます)によっては、発光持続の減衰が一般よりも早まる可能性を認識いたしました。今後ECL Primeをご検討いただくお客さまにとっても大変参考となる貴重な内容であり、抗体濃度との関連を中心に、弊社でも検証を続けていきたく存じます。

感想欄にご記入いただいたように、貴重な抗体を用いる場合には、ECL Primeを用いることで抗体を節約してご使用いただけるかと存じます。異なる条件でご検討いただく機会がございましたら、お手数かと存じますが、是非、ご連絡いただけますよう宜しくお願い致します。お待ち申しております。

投稿者 GEヘルスケア担当 H
投稿者所属 GEスタッフ
投稿日 2011年02月03日

お待たせして大変申し訳ございません (GEヘルスケア)

ECL Primeの製品評価および実験結果の公開に格別のご協力をいただき、誠にありがとうございます。
お忙しい中、ご協力をいただいたにも関わらず、長い間お待たせすることとなり大変申し訳ございません。
予想を超える反響に十分な体制を準備できていませんでしたことが、このようにお待たせする原因となりました。
現在テクニカルスタッフの体制を増強して個別に回答・ご提案を準備中です。
(2月10日より順次、回答・ご提案を掲載予定です。)

どうかこれからも、GEヘルスケア・ジャパンをよろしくお願いします。