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ECL/ECL Prime/ECL Selectを使ったウェスタンブロッティングの結果およびご感想

ECL plusとECL Primeの比較

検出結果画像
検出画像1

投稿者 ECL Plus Heavy User
投稿者所属 大学 講師
投稿日 2010年12月19日
今回お使いいただいた試薬
ECL Prime
サンプル由来
精製タンパク質
サンプル調製方法
CHO細胞にて遺伝子発現を行ったタンパク質(カルシウム依存でマンノースに結合)をMannan agaroseに結合させ、カルシウムキレート剤であるEDTAを含むTBS bufferにて溶出させた。
1ウェルあたりのサンプルアプライ量(µg)
10
1ウェルあたりに含まれる目的タンパク質の量(ng)(推定)
10-100
目的タンパク質の名前
Confidential
検出結果 & 検出条件 検出手段
CCDイメージャー
使用した製品名(CCDイメージャーの場合)
LAS-3000
検出画像へのコメント
検出画像1:ECL plusとECL Primeの比較を行いましたが、検出感度としてはPrimeの方が良好でしたが、Backの上がりがplusより若干高い結果でした。
検出画像2:
検出画像3:
露出時間
検出画像1:10 min
検出画像2:
検出画像3:
一次抗体
anti-X rabbit polyclonal antibody, affinity purified
一次抗体の希釈倍率(1:X)
1 ug/mL
二次抗体
anti-rabbit IgG HRP conjugated 1 mg/mL (Chemicon)
二次抗体の希釈倍率(1:X)
10000
普段主にお使いの検出試薬
ECL Plus
ECL/ECL Prime/ECL Selectをお使いいただいた際に変更した条件
変更していない
ECL/ECL Prime/ECL Selectをお使いいただいた感想など
通常plusを使用していますが、感度に関してはPrimeの方が良好でした。
Backの上昇が少し見られましたが、条件を調整することによりplusよりも高感度、高S/Nが得られると思われます。
今後しばらく併用し、Primeへの切り替えを検討したいと思います。

 

投稿者 GEヘルスケア
投稿者所属 サポートスタッフ
投稿日 2011年02月14日

ご投稿頂きありがとうございます。(GEヘルスケア)

お忙しい中、ECL Plusとの比較結果をご投稿をしていただき、誠にありがとうございました。ご指摘のとおり、ECL Primeの方が感度がよい分、条件によってはバックグラウンドの上昇が目立つことがございます。バックグラウンドを抑えるための検討点について、ご提案させていただきます。ご参考になれば幸いです。

【提案1、露出時間を短くする】
微弱なシグナルを検出しにくくなるためバックグラウンドの低下が見込めます。まずは、ECL Plus検出時の半分程度の露出時間を目安にお試しください。

【提案2.  抗体濃度を下げる/抗体の希釈倍率を高くする】
希釈倍率を高くして抗体濃度を下げることで、バックグラウンドの改善が見込めます。参考としてECL Primeデータファイル図6(4ページ)をご参照ください(http://www.gelifesciences.co.jp/technologies/ecl/pdf/342011.pdf )。
目安として、tm様のご検討いただいた条件から、一次抗体および二次抗体の希釈倍率をともに2~3倍程度高くしてお試しください。

【提案3. 抗体希釈溶液にブロッキング剤を添加する】
ブロッキング時と同じ溶液にて一次抗体、二次抗体を希釈して処理する方法です。バックグラウンドの低下が見込めますが、目的タンパク質のシグナル強度も弱くなる側面もあるため、目的タンパク質がはっきり検出されている系での有効な改善手法としてご認識ください。

投稿者 GEヘルスケア担当 H
投稿者所属 GEスタッフ
投稿日 2011年02月03日

お待たせして大変申し訳ございません (GEヘルスケア)

ECL Primeの製品評価および実験結果の公開に格別のご協力をいただき、誠にありがとうございます。
お忙しい中、ご協力をいただいたにも関わらず、長い間お待たせすることとなり大変申し訳ございません。
予想を超える反響に十分な体制を準備できていませんでしたことが、このようにお待たせする原因となりました。
現在テクニカルスタッフの体制を増強して個別に回答・ご提案を準備中です。
(2月10日より順次、回答・ご提案を掲載予定です。)

どうかこれからも、GEヘルスケア・ジャパンをよろしくお願いします。