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ECL/ECL Prime/ECL Selectを使ったウェスタンブロッティングの結果およびご感想

ECL PrimeとPlus

検出結果画像
検出画像1

検出画像2

投稿者 saisai
投稿者所属 大学 講師
投稿日 2010年12月19日
今回お使いいただいた試薬
ECL Prime
サンプル由来
プライマリー細胞
サンプル調製方法
1%NP40含むTris/NaCl系バッファー
1ウェルあたりのサンプルアプライ量(µg)
10
1ウェルあたりに含まれる目的タンパク質の量(ng)(推定)
N/A
目的タンパク質の名前
NFATc1
検出結果 & 検出条件 検出手段
X線フィルム
検出画像へのコメント
検出画像1:
検出画像2:
検出画像3:
露出時間
検出画像1:ECL Plus 1時間後(暴露5分)
検出画像2:ECL Prime 1時間後(暴露1分)
検出画像3:
一次抗体
抗NFATc1モノクローナル抗体
一次抗体の希釈倍率(1:X)
1:8000
二次抗体
抗マウスIgG-HRP抗体
二次抗体の希釈倍率(1:X)
1:10000
普段主にお使いの検出試薬
ECL Plus
ECL/ECL Prime/ECL Selectをお使いいただいた際に変更した条件
変更していない
ECL/ECL Prime/ECL Selectをお使いいただいた感想など
1次抗体の希釈に5%BSA/TBSTを用いている。
他の抗リン酸化抗体を用いる場合にも、
5%BSA/TBSTで希釈しているが、同様に高い
バックグラウンドを認めた。BSAを用いる場合、
Primeでは更に抗体の希釈等が必要かもしれない。

 

投稿者 GEヘルスケア
投稿者所属 サポートスタッフ
投稿日 2011年02月14日

ご投稿ありがとうございます。(GEヘルスケア)

ECL Primeの評価結果について詳細な実験条件および画像データをご投稿いただきありがとうございました。
バックグラウンドの上昇が見られ、ご期待に沿う結果が得られず申し訳けございません。露出(暴露)時間の調節や抗体の希釈をブロッキング剤入りのものをお使いいただくなど、バックグラウンド低減のためのご検討を既にいただいているとのこと。弊社からも下記2点を提案をさせていただきたく、次回お試しいただく際にご参照いただけましたら幸いです。
また、もしお時間いただけるようでしたら直接お話しをさせていただきたく、お手数ですがバイオダイレクトライン(TEL:03-5331-9336 / E-mail:Tech-JP@ge.com)までご連絡いただけましたら幸いです。
【案1.  抗体濃度を下げる抗体の希釈倍率を高くする】
希釈倍率を高くして抗体濃度を下げることでバックグラウンドが低減する事例がございます。参照データとしてECL Primeデータファイル図6(4ページ)をご覧ください。(http://www.gelifesciences.co.jp/technologies/ecl/pdf/342011.pdf )。
希釈の目安ですが、ご投稿いただいた評価試験の条件より、一次抗体および二次抗体の希釈倍率をそれぞれ3倍程度高くしてお試しいただけませんか。

【案2. 試薬添加後、5分後に検出を行う】
ECL Primeの試薬特性として、シグナルが微弱なものほど、試薬添加後の時間の経過とともにシグナルが増強される傾向がございます。今回、1時間後に1分暴露いただいておりますので試薬添加後5分程度の検出で、目立たないような微弱なバックグラウンドシグナルが増強されている可能性がございます。また、目的バンドのシグナル強度もかなり高いと見受けられますので、今回投稿いただいた抗体濃度の場合であれば試薬添加5分後に10秒程度の露出時間でも十分なシグナルを得られると考えております。

投稿者 GEヘルスケア担当 H
投稿者所属 GEスタッフ
投稿日 2011年02月03日

お待たせして大変申し訳ございません (GEヘルスケア)

ECL Primeの製品評価および実験結果の公開に格別のご協力をいただき、誠にありがとうございます。
お忙しい中、ご協力をいただいたにも関わらず、長い間お待たせすることとなり大変申し訳ございません。
予想を超える反響に十分な体制を準備できていませんでしたことが、このようにお待たせする原因となりました。
現在テクニカルスタッフの体制を増強して個別に回答・ご提案を準備中です。
(2月10日より順次、回答・ご提案を掲載予定です。)

どうかこれからも、GEヘルスケア・ジャパンをよろしくお願いします。