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ECL/ECL Prime/ECL Selectを使ったウェスタンブロッティングの結果およびご感想

ECL Prime

投稿者 MUKU
投稿者所属 大学 准教授
投稿日 2010年12月01日
今回お使いいただいた試薬
ECL Prime
サンプル由来
細胞株
サンプル調製方法
RIPAバッフアーにて溶解
1ウェルあたりのサンプルアプライ量(µg)
5-20
1ウェルあたりに含まれる目的タンパク質の量(ng)(推定)
N/A
目的タンパク質の名前
Confidential
検出結果 & 検出条件 検出手段
X線フィルム
検出画像へのコメント
検出画像1:
検出画像2:
検出画像3:
露出時間
検出画像1:
検出画像2:
検出画像3:
一次抗体
Confidential
一次抗体の希釈倍率(1:X)
1:1000-1:5000
二次抗体
HRP-conjugated anti-rabbit IgG
二次抗体の希釈倍率(1:X)
1:50000
普段主にお使いの検出試薬
ECL Plus
ECL/ECL Prime/ECL Selectをお使いいただいた際に変更した条件
一次抗体の希釈倍率
二次抗体の希釈倍率
変更内容詳細
一次抗体の希釈倍率を2-5倍。
二次抗体の希釈倍率を10倍。
ECL/ECL Prime/ECL Selectをお使いいただいた感想など
ECL Plusより感度は高いが、バックグラウンドも高くなりやすいので、特に二次抗体反応後の洗いは十分行なう必要がある。
反応時間が長いので、露光時間の調節がやりやすい。

 

投稿者 GEヘルスケア
投稿者所属 サポートスタッフ
投稿日 2010年12月02日

ご投稿ありがとうございます。(GEヘルスケア)

ECL Plusとの比較結果をご投稿いただきまして、ありがとうございます。
一次抗体、二次抗体の希釈倍率を上げても、ECL Primeで充分な感度が得られたようで、うれしくおもいます。また、ECL Primeは「反応時間が長いので、露光時間の調節がやりやすい。」とのコメントもありがとうございます。抗体量を変更すると、露光時間の検討が必要になりますが、反応時間が長い(=発光安定性が高い)という特徴が実際の実験に有効であることを確信することができました。
MUKU様が感じていらっしゃる「ECL plusより感度は高いがバックグラウンドが上がりやすい」ということは、検討実験のなかで私どもも感じた点でした。ECL PrimeはECL Plusと比較すると感度が高いため、抗体の量が多いときにバックグラウンドの上昇が目立ちやすいですね。検討実験では、ECL Primeの露出時間をECL Plusの半分に変更すると、同等の検出感度を保ちながら、バックグラウンドも気にならないデータを得ることができました。また、抗体希釈溶液にブロッキング剤を入れる事で、バックグランドを抑えられることを確認しております。しかし、全体的なシグナル強度も弱くなりますので、今のところクリアなバンドの検出に対して有効な方法です。さらに有効な方法を確認できましたら、Tipsのような形にまとめて情報をアップデートさせていただきたいと思います。