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ECL/ECL Prime/ECL Selectを使ったウェスタンブロッティングの結果およびご感想

ECL prime

検出結果画像
検出画像1

投稿者 maru
投稿者所属 大学 助教
投稿日 2010年11月30日
今回お使いいただいた試薬
ECL Prime
サンプル由来
プライマリー細胞
サンプル調製方法
Preparation buffer:HEPES buffer(pH7.2)
50mM HEPES,150mM Nacl,
0.5% NP-40 with protease inhibitor
1ウェルあたりのサンプルアプライ量(µg)
3 µg
1ウェルあたりに含まれる目的タンパク質の量(ng)(推定)
30-100ng
目的タンパク質の名前
Myosin Light Chain (upper band: Phosphorylated MLC)
検出結果 & 検出条件 検出手段
CCDイメージャー
使用した製品名(CCDイメージャーの場合)
BIO-RAD ChemiDoc XRS-J
検出画像へのコメント
検出画像1:
検出画像2:
検出画像3:
露出時間
左より2組ごと、2,3,5,7.5,10分間
一次抗体
anti MLC (Rabbit polyclonal, SANTA CRUZ)
一次抗体の希釈倍率(1:X)
x1000
二次抗体
anti Rabbit IgG-HRP (SIGMA)
二次抗体の希釈倍率(1:X)
x1000
普段主にお使いの検出試薬
ECL Plus
ECL/ECL Prime/ECL Selectをお使いいただいた際に変更した条件
変更していない
変更内容詳細
ECL/ECL Prime/ECL Selectをお使いいただいた感想など
Sampleは同一membrane上に転写し、Western blotを行い
検出直前に2枚に切り分け、ECL plus, ECL primeで
反応させ検出しました。ELC plusを初めて使用した時の
様な感動を期待していましたが、予想に反してECL plus
の方がよい結果でした。

今回のWestern blotは普段から上手くいっているもの
なので次回は検出困難なものにトライしてみようと
思っています。
よい結果が出ましたら、また報告させていただきます

 

投稿者 GEヘルスケア・ジャパン スタッフ
投稿者所属 システム管理者
投稿日 2011年01月20日

リン酸化体と非リン酸化体の分離

maru様

下記のお問合わせをいただきましたので、代理で投稿いたします。ご回答いただけましたら幸甚です。

管理者より

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参考になりました。ところで、リン酸化体と非リン酸化体はどのようにして分離したのでしょうか?

投稿者 GEヘルスケア
投稿者所属 サポートスタッフ
投稿日 2010年12月01日

ブロッキング剤と検出感度について (GEヘルスケア)

このたびは、検出感度の向上に期待をもってECL Primeをお試しいただいたにもかかわらず、期待を裏切る結果となってしまい大変申し訳ありません。さらに、再度ECL Primeの検出条件についてご検討いただけるとのコメントもいただき、感謝申し上げます。

【ご提案: ブロッキング剤を抜いた抗体反応溶液での検出】
私どもが実施した検討でも、5% BSAをブロッキング剤として加えた条件にて比較を行ったところ、ECL PlusよりもECL Primeの検出感度が低下したケースがありました。その結果を踏まえ、TBS-T、PBS-Tのみを抗体反応溶液に使用したところ、ECL Plusよりも優れた検出感度を示しました。

上記内容を含めまして、もしお時間をいただけるようでしたら、再度ECL Primeを用いて検出する際の条件について、一緒に検討させていただきたく存じます。ご都合の良い時間に、バイオダイレクトライン(TEL:03-5331-9336 / E-mail:Tech-JP@ge.com)までご連絡をいただければ幸いです。

maru様のご報告を受けまして、弊社でも、引き続きブロッキング剤について十分に検討を続けたく存じます。追加の情報はWebサイトにアップしてまいります。